초저온 냉동보존법(ultra-freezing)

초저온 냉동보존법(ultra-freezing)

 

○ 장기보존을 위해서는 동결되어 -50 ~ -80℃ 범위에서 보존

 

○ 초저온 냉동기(-80℃), 액체질소(-196℃), 액체질소증기(-150℃)에서 얼린 상태로 보존

 

○ 초저온 냉동고는 고장이나 정전에 주의, 액체질소는 유지비가 많이 드는 단점이 있음

 

○ 일반적인 보존 기간은 -60℃에서 5년간으로 보고되고 있다

 

○ 동결보존제(cryoprotective agent);

    - 글리세롤(glycerol)과 디메틸 술폭시드(dimethyl sulfoxide, DMSO)

          - 세포막을 쉽게 통과하여 세포 내부와 외부가 빙점 이하로 떨어지는 것을 방지

          - 설탕, 유당, 포도당, 만니톨(mannitol), 소르비톨(sorbitol), 덱스트란(dextran), 폴리글리콜(polyglycol) 같은

            동결보호제는 세포막 밖에서 동결을 방지

          - 글리세롤과 DMSO가 널리 사용됨

    - 일반적으로 글리세롤은 10%, DMSO는 5%가 최적 농도

    - 글리세롤은 고압살균(autoclaving)으로, DMSO는 막 여과기(membrane filter)로 멸균

    - 5℃에서 얼린 상태로 보존한다(DMSO의 빙점은 18℃)

 

○ 배양액 준비;

    - 대수증식기 후기의 균사체를 사용

    1) 사면배양:

    - 10% glycerol가 포함된 nutrient broth 10㎖를 사면시험관에 넣고 포자와 균사체를 긁어낸다.

    - 세포현탁액을 2㎖씩 동결용 vial에 분주하고 냉장고에서 30분간 방치하여 균사체와 현탁액간의 평형이

      이루어지도록 한다.

    2) 액체배양액

   - 동량의 20% glycerol 또는 10% DMSO를 동량 첨가한 잘 혼합한다.

   - 세포현탁액을 2㎖씩 동결용 vial에 분주하고 냉장고에서 30분간 방치하여 균사체와 현탁액간의

     평형이 이루어지도록 한다.

 

○ 동결시 냉각 원칙;

  - 동결시 냉각속도(cooling rate)는 미생물의 생존에 중요한 요소로 작용

  - 일반적으로 느린 냉각속도(1～2℃/min)가 냉동보존법에 적당하다.

 

○ 해동 원칙;

  - 동결된 균주를 녹이기 위해서는 ampoule을 37～40℃의 water bath에 넣고 가볍게 흔들어 녹인다.

  - 유리 앰플의 경우 약 40～60초가 소요된다.

  - 다녹으면 꺼내어 표면을 70% 에탄올로 소독한 후 개봉하여 사용한다.